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利用相位差显微镜观察-细胞存活测定实验步骤

利用相位差显微镜观察-细胞存活测定实验步骤
细胞存活、死亡之测定法
一、 相位差显微镜(phase-contrastmicroscope)利用相位差显微镜,观察给药前后细胞型态,以了解细胞经药物处理后型态的变化,评估药物对细胞状态的影响。
二、 细胞存活率之测定:MTT 还原分析法(3-(4,5-dimethylthianol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide reduction assay)
一、原理
正常健康的细胞,其细胞粒腺体内膜的琥珀酸去氢醣(succinate dehydrogenase)具有将 MTT(黄色)还原为 MTT-formazan(紫色)的能力。而紫色颜色的深浅程度可代表还原能力的强弱,即琥珀去氢醣的活性,同时也反应粒腺体的生理状况。由于粒腺体是细胞内对环境因素最为敏感,因此粒腺体的生理状况可代表细胞的生理状况。当还原能力强时,表示克氏循(Kreb’s cycle)环进行速率快,可产生较多的能量供细胞使用,故可代表细胞的健康情形良好
二、试剂
1. 5mg/ml MTT 溶液(溶剂:1X PBS),避光 4℃保存。
2. Dimethyl sulfoxide(DMSO):Sigama
三、实验步骤
1. 每孔留下 350μl 的留胞培养液,加入 35μl MTT 溶液(黄色),避光并静置室温下反应 1 小时。
2. 移除含有 MTT 的细胞培养液,加入 350μl DMSO 以溶解紫色颗粒。待紫色颗粒完全溶解后,每孔各取 125μl 的紫色溶液置入 96-wellRIA/EIA plate 中,设定波长为 570 nm(630 nm 当作参考波长),测其吸光值。吸光值越高,表示 MTT-formazan 产量越高,即代表细胞之存活率越高。

3. 计算细胞细胞存活率=样品吸光值 / 控制组吸光值 × 100﹪

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